蔡扩军，妥彦峰，徐敏,4，罗晓红,吴林英，尤宏，寇晓萌，牟光庆，郑志强，李新玲,4*
（1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，乌鲁木齐 830063；
2.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034 ；
3.新疆天润乳业股份有限公司，乌鲁木齐 830000; 4.乌鲁木齐市奶业协会，乌鲁木齐 830000, 5.新疆旺源驼奶实业有限公司，新疆 福海 836400）
我国传统发酵乳历史悠久，在新疆、西藏、内蒙古等地区都具有风味丰富、质地优良、营养价值颇高的传统发酵乳。由于乳源、地区气候以及发酵菌种等因素使得我国各地区传统发酵乳的品质具有较大差异。新疆为山脉与盆地相间排列、盆地与高山环抱，被喻称为“三山夹二盆”[1]，不同区域内的气候条件差异很大[2]。新疆也是多民族聚居的省区[3]，多数少数民族喜居于水土丰沃的绿洲和山地草原等地区，这里的人们一直保留着饲养牛、羊、马、驴和驼等动物的习惯，靠自留“引子”自制发酵乳制品[4]。自制发酵乳制品的“引子”历经牧民世代接种传承，“引子”中的微生物在长期的自然进化和演变后蕴藏着丰富的发酵菌种资源，是“天然菌种库”[5]。
但是，随着乡村城镇化和工业科技的发展，传统工艺不断被新技术取代，其中极具价值的微生物资源也可能会逐渐消失，因此挖掘并保存新疆地区的传统发酵乳制品中的微生物菌种资源具有重要意义。鉴于此，本研究对新疆辖区内主要地州及乌鲁木齐周边的乡村主要饲养牛、马、驴和驼的牧民自制的传统发酵乳制品进行了调研，同时采集样品，并对其中的微生物菌种进行了多样性分析和初步筛选，以期为后续新疆传统发酵制品微生物菌种资源的开发和利用打下基础。
1.1 调研与样品采集
对新疆辖区内12 个地州及乌鲁木齐周边共45个县165 个乡村饲养牛、马、驴和驼的牧民家庭进行了采访调研，调研内容主要包括咨询牧民自制发酵乳制品的时间、“引子”的来源、制备材料和方法、用途等内容。采集了483 份连续使用5 年以上“引子”的传统发酵乳样品，液体样品使用250 m L 无菌采样瓶（200 m L 左右）采集，固体样品使用无菌采样袋采集。做好标记，用冰袋和车载冰箱低温保藏运送至实验室，进行微生物多样性分析以及菌株的筛选和分离。
1.2 试剂及药品
M RS 肉汤培养基，北京陆桥技术有限责任公司；
DN easy Pow erSoil Pro Kit 试剂盒，美国Q IAGEN 公司；
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 试剂盒，美国Axyen 公司；
E.Z.N.A. soil DN A 试剂盒，美国Om ega Bio-tek 公司；
琼脂糖，西班牙Biow est 公司；
1,2-二氟苯，上海阿拉丁有限公司；
FastPure Bacteria DNA Iso lation Mini Kit、溶菌酶、2 × Phanta M ax M aster Mix、U ltra GelRed，南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.3 仪器
ABI GeneAm p 9700 PCR 仪，美国ABI 公司；
Illumina Miseq 测序仪，美国Illumina 公司；
SW-CJ-1FD 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
Agilent 7890B-5977A 气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦科技公司；
M upid 2 p lus 水平电泳仪，日本M upid 公司；
C 300 化学发光成像仪，美国Azure biosystem s 公司；
DYY-6C 电泳仪，北京市六一仪器厂。
1.4 发酵乳菌群分析
对新疆传统发酵乳中细菌多样性进行分析，使用E.Z.N.A. soil DNA 试剂盒对发酵乳中的细菌进行DNA抽提。并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取质量，使用N anoD rop2000 测定DN A 的浓度和纯度。使用通用引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTW TCTAAT) 对16S rRNA 基因V 3-V 4 可变区进行PCR 扩增，扩增程序如下：95 ℃预变性3 min，27 个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s），然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存。利用Illumina 公司的Miseq PE300/N ovaSeq PE250 平台进行测序。通过fastp[6]（https://github.com/O penGene/fastp，version 0.20.0）软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH[7]（http://www.cbcb.um d.edu/so ftw are/flash，version 1.2.7） 软件进行拼接：UPARSE[8]软件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根据97%的相似度对序列进行O TU 聚类，并使用Silva 16S rRN A 数据库（version 138）进行数据比对。
采用M o lPure Fungal DNA Kit 提取试剂盒对新疆传统发酵乳中真菌DNA 进行提取。使用通用引物ITS1F（CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2F（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）进行扩增，扩增程序如下：95 ℃预变性3 min，35 个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃稳定延伸10 min。使用ITS 数据库进行数据比对。
2.1 新疆传统发酵乳制作环境条件
调研中发现，新疆辖区内12 个地州及乌鲁木齐周边环境条件存在差异，即此次调研的不同地区传统发酵乳制品制作的原料环境条件不同。表1 列出了本次调研的新疆12 个地区的主要地理条件和制作发酵乳奶源的主要畜种。所调研的不同牧区，环境温度存在一些差异，会使发酵过程中微生物的代谢产物存在差异。以牛、羊、马或驼乳作为发酵的原料乳，参与发酵的微生物会存在差异。
表1 新疆不同地区气候条件和发酵乳特点
表2 新疆不同地区传统发酵乳筛选主要乳酸菌菌株数量/株
2.2 新疆传统发酵乳制作方法
新疆12 个不同地州传统发酵乳的发酵方法有所不同，而发酵乳所用的“引子”均主要为当地牧民世代传承下来的，并未采用任何商业发酵剂。塔城地区额敏县边境某牧区的多户牧民表示，发酵用的“引子”源自出生几天内刚死亡的犊牛/羊胃中的乳糜；
乌什县某户农牧民表示发酵酸奶的初始“引子”为发面酵头；
阿勒泰富海县有牧民表示“引子”就是把挤出的新鲜奶加入洋葱放在帐篷内，待其自然变酸。
新疆不同地州传统发酵乳，其原料乳基本来自家养的牛、马、驼和驴乳，且发酵乳基本自用，制作时间5~80 年。
新疆不同地州传统发酵乳的制作方法差别不大，共同特征为：饲养乳畜经手工挤奶后先用纱布过滤，鲜奶在锅里进行加热煮沸，待冷却至不烫手，倒入专门容器内；
再加入前一次发酵成熟的发酵乳作为发酵剂，用勺子搅拌匀，盖上盖子，天冷时盖上棉被置于火炉旁，通常在室温下发酵，待凝乳后，即可食用。马、驼和驴挤奶经过滤后直接加入上次“引子”常温自然发酵，前两天常搅拌，发酵5~7 d 后待酸香味适宜时，即可饮用。在阿勒泰也有部分牧民将驼乳和马乳经过滤后再煮沸，待冷却至室温后，加入上次“引子”在常温下自然发酵。
专业理论知识与工程实践结合的课堂教学 在实际的专业课教学中，为了将理论知识与工程实践相结合，并引入实际课堂教学中，采用以下步骤进行。
草原上不同少数民族制作的传统发酵乳制品的感官差异很大。发酵牛乳通常看起来凝乳细腻、且轻轻搅拌后呈豆花状、黏稠提拉呈丝状、或糊状有微量气泡，很少有乳清析出现象；
闻起来有焦香味、花香味、或醇香味、多数为常见酸奶的发酵风味；
喝起来呈焦香味、有些许尖酸刺激味，多数酸味柔和，少有膻腥、饲草味。存放过程中少有发霉现象，有些牧民家的酸奶存放半年仍可正常食用，存放满1 年仍无霉变、香味浓郁，尝微苦。阿勒泰地区的酸驼乳和酸马乳呈液体状态，不同于牛羊乳的凝乳状态。
2.3 微生物多样性分析
2.3.1 细菌和真菌多样性分析
采用焦磷酸测序的方法对南疆三地州喀什（KS）、和田（HT）、阿克苏（AKS）、哈密地区（HM）、与北疆地区塔城（TCEM）、博州（BZ）、伊犁（YL）等地的代表性样品进行细菌和真菌的生物多样性分析。
从图1 中可以看出，新疆传统发酵乳制品中南疆地区的HM 21 及北疆地区TC_19 地区的细菌微生物多样性高于其他组。
图1 细菌香农指数分析
从图2 中可以看出，新疆传统发酵乳制品中南疆地区的HM 21、北疆地区的YL_GL_5 组的真菌微生物多样性同样高于其他组。
图2 真菌香农指数分析
从图3 中可以看出，在多个传统发酵乳样品中检测到的Lactobacillus_delbrueckli_subsp_bulgaricus（HTYT、YJS 35、AKSW S4、HM 19、YC 37、KSSL30、YL_CX、YL_YN、YL_ZS、TC_15）和Lactobacillus_helveticus（HM 13、HM 1、HM 4、HM 12、HM 14、HM 17、HM 19、YL_TKS、BZ_W Q_7、TC_10、BZ_W Q_2），是新疆传统发酵乳的主要优势菌株；
其次含有一定量的Streptococcus_salivarius_subsp_themophilus（HTYT 39、HTYT 42、YJS36、YJS35、AKSW S4、YC 37、KSSL30、YL_CX、TC_15）。
图3 细菌菌群种水平Bar 图
从图4 中可以看出，在多个传统发酵乳样品中检测到的Kluyveromyces_marxianus（HTYT 42、HM 13、AKSW S4、HM 19、YC 37、KSSL30、YL_TKS、YL_ZS）和Geotrichum_bryndzae（YL_CX、YL_GL、YL_YN、YL_ZS、BZ_W Q_7、TC_15、TCEM_19、YJS35、HM 1 和HM 4），是新疆传统发酵乳的主要优势菌株；
另外一些地区发酵乳中检测到的Saccharomyces_sp（TC_10、YL_YN）、Dekkera_bruxellensis（YL_TKS）、Issatchenkia_orientalis（HM 12、HM 14）和Candida_sake（HTYT 41、HTYT 42）并不具有普遍性。
图4 真菌菌群种水平Bar
2.3.2 细菌和真菌差异性分析
图5 细菌种水平组间差异分析
伊犁（YL_GL_5） 地区的Lactococcus-raffinolactis（P<0.05）、博州两地区Lactobacillus-kefir（P<0.05）以及塔城地区（TCEM 19）Acetobacter-orientalis（P<0.05）相对丰度明显多于其他地区。
乳酸菌和酵母菌是传统发酵乳中发酵剂的主要微生物组成。由乳酸菌主导的乳酸发酵与酵母菌主导的乙醇发酵及其发酵副产物对传统发酵乳制品风味的形成具有显著影响。从图6 中可看出，各新疆传统发酵乳样品中普遍存在Geotrichum_bryndzae，而在塔城两地区的Saccharomyces_sp（TCEM 10）和Candida_sake（TCEM 15） 的相对丰度显著高于其他地区（P <0.05）；
在伊犁（YL_TKS_3、YL_YN_1、YL_ZS_4）地区的Kluyveromyces_marxianus相对丰度显著高于其他地区（P<0.05）。乳酸菌与酵母共存的模式赋予新疆传统发酵乳醇厚、清新的口感，使其与商业发酵乳的风味具有明显差异[9]。乳酸菌通过乳酸发酵途径水解乳糖产生乳酸，使乳酸化[10]；
YL_YN_1 含有丰富的乳杆菌，可促进乳的酸化；
Lactobacillus_delbrueckli_subsp_bulgaricus，具有良好的产酸能力，是商业发酵乳的首选发酵剂之一[11-12]。Lactobacillus_helveticus为同型乳酸发酵菌种，具有良好的产酸及蛋白水解能力[13]。酵母菌具有良好的蛋白水解能力，对发酵乳的质构和风味具有积极影响[14-15]。与乳酸菌相比，酵母菌对营养要求相对较低，糖、氨基酸、微生物、矿物质、氧气等基本化合物的存在即可支持酵母菌的生长代谢[16]；
而乳酸菌的生长代谢有更多的营养物质需求，这也使得在乳酸菌酵母菌共生的体系中，酵母菌代谢产生的各类氨基酸能够有效促进乳酸菌生长代谢[17]，乳酸菌与酵母菌在传统发酵乳中复杂的共生关系和碳、氮代谢途径相互作用的结果是形成丰富风味的原因。
图6 真菌种水平组间差异分析
通过以上分析，确定了新疆不同地区传统发酵乳制品中主要的优势微生物，包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌和马克斯克鲁维酵母菌。
2.4 样品中筛选出的代表性菌株
基于微生物表型技术和糖代谢特性结合基因技术，利用改良培养基M RS 和PDA 从采集的样品中筛选出乳杆菌、乳球菌、明串珠菌和乳源性肠球菌4 大类菌，其中以植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、假肠膜明串珠菌、肠膜明串珠菌亚种、乳源肠球菌中的屎肠球菌、粪肠球菌和耐久肠球菌为代表的乳酸细菌等497 株；
筛选出以发酵乳糖的马克斯克鲁维酵母为代表的乳酸酵母及非乳糖酿酒酵母、发酵毕赤酵母、东方伊莎酵母、胶红酵母、膜醭毕赤酵母、戴尔有孢酵母、汉逊得巴利酵母、乙醇假丝酵母、清酒假丝酵母和白地霉等真菌；
并于国内首次发现现未命名的Kazachstania servazzi、Pichia cactophila、Coniocheataceae sp.和Meyerozyma guilliermondil等菌株，共364 株。
从样品中筛选出的菌属与微生物多样性分析结果基本相符，且部分菌株已在企业开始应用研究，将发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和马克斯克鲁维酵母应用于乳的发酵，获得了风味、感官及营养较好的发酵乳产品[14,18]。对未筛选出优势菌种中的嗜热链球菌，分析可能是由于嗜热链球菌不耐酸以致失活或在35 ℃温度下培养的嗜热链球菌的菌落过小且特征不明显所致。
一些发酵乳制品存在多菌株参与发酵。副干酪乳杆菌、耐久肠球菌和发酵乳杆菌等普遍应用于希腊奶酪[19]、乳扇[20]和发酵牦牛乳[5]等传统发酵乳制品中，使其具有丰富的风味成分和有益代谢产物。鼠李糖乳杆菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌共同发酵羊乳时，有利于提高发酵乳的质地、并降低乳中的羊膻味[21]。新疆传统发酵乳中多样的微生物构成，正是形成其独特风味的原因。
2.5 新疆传统发酵乳制品及发酵菌株的安全性
以上所分离的植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌、马克斯克鲁维酵母均在国家卫生健康委员会（卫生部）发布的可用于食品的菌种名录中。对新疆传统发酵乳中的微生物进行了分离保藏，并对部分地区的发酵乳制品中的相应的部分微生物进行了安全性评价，包括对细胞毒性的评价、实验动物灌胃实验，未发现所研究菌株和发酵乳具有毒性[14, 18,22]。
在对新疆不同牧区的传统发酵乳制品进行调研和采集过程中，发现新疆传统发酵乳是当地人民的日常食品，具有长期的食用史，因此认为其是具有安全性的传统食品，同时也是开发食品有益微生物的良好资源[23-24]。
对新疆12 个地州及乌鲁木齐周边共45 个县165个乡村的传统发酵乳制品展开了调研，进一步证明了新疆传统发酵乳制品中蕴含丰富的食品用微生物菌种资源。新疆传统发酵乳制作过程中不涉及任何商品发酵剂。从新疆传统发酵乳中共筛选出497 株乳酸菌和364 株酵母菌，并首次发现了假肠膜明串珠菌、汉逊德巴利酵母和巴氏醋杆菌等菌。部分菌株已在企业开始应用研究，开发新疆传统发酵乳制品的优质菌种资源可为我国发酵乳制品生产提供具有自主知识产权的菌株。
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