王思懿,胡 颖,刘小玉,荆 欣,冯佩林,朱乐冉,姚雨桐,陈大福,2,郭 睿,2*,徐国钧*
(1. 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福州 350002;2. 福建农林大学蜂疗研究所,福州 350002)
意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称意蜂),是一种优良的西方蜜蜂Apismellifera亚种,具有优越的采集和造脾能力,在养蜂生产中广泛使用(曾志将, 2009)。东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae特异性侵染成年蜜蜂的中肠上皮细胞,可引起宿主的细胞凋亡和免疫应答抑制,消化系统紊乱,记忆受损和寿命缩短,导致的微孢子虫病给养蜂生产造成较大损失(Burnham, 2019)。目前,东方蜜蜂微孢子虫广泛感染世界各地的饲养蜂群(梁勤和陈大福,2009)。虽然东方蜜蜂微孢子虫的参考基因组(Pelinetal., 2015)和全长转录组均已公布,但转基因操作技术体系的缺失导致相关基因功能研究较为滞后。
脂肪酸辅酶A连接酶(fatty acid CoA ligase,FAL)也称脂酰辅酶A合成酶(acyl-CoA Synthetase,ACS)在真核细胞中广泛存在,催化长链脂肪酸转化为酰基辅酶A,在脂质生物合成、能量合成及基因表达调控等方面起到重要作用(Dongetal., 2012)。Sung(2007)等研究发现用脂肪酸辅酶A连接酶家族的抑制剂Triacsin C处理后,细胞的生长受到抑制,且细胞凋亡显著增加。Tenagy(2019)等发现在培养基中加入Triacsin C后,3种马拉色菌Malasseziaspp.的生长受到抑制且这种抑制与Triacsin C呈剂量依赖关系。然而,东方蜜蜂微孢子虫的LCFAL研究迄今仍然缺失,相关信息匮乏。
前期研究中,笔者团队测定了东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程中nce-miR-15338及其靶基因LCFAL2在的表达谱,发现二者均呈持续下降的表达趋势(未发表数据)。本研究对东方蜜蜂微孢子虫孢子中的LCFAL2基因进行表达验证,进而分析LCFAL 2蛋白的分子特性,并对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的LCFAL 2进行系统进化分析,以期丰富东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2的基本信息,并为深入开展LCFAL2的功能研究提供依据。
1.1 LCFAL 2基因的生物信息学分析
根据前期预测出的东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2序列,利用NCBI网站上(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)的ORF工具对LCFAL 2的氨基酸序列进行预测。通过Expasy网站(https://www.espasy.org/resources)上的Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析LCFAL 2的理化性质、亲水性和三级结构。采用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。通过PSORTⅡ软件(Sedaghat-Nejadetal., 2021)进行亚细胞定位预测。
1.2 LCFAL 2蛋白的保守基序和结构域预测
使用MEME软件(Bailey and Elkan, 1994)预测东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae、蜜蜂微孢子虫Nosemaapis、东方赤孢子虫Hamiltosporidiumtvaerminnensis、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoonintestinalis、兔脑炎微孢子虫Encephalitozooncuniculi、巨蟹肠孢菌Enterosporacanceri、毕氏肠细胞虫Enterocytozoonbieneusi、烟粉虱Spraguealophii、管孢属微孢子虫Tubulinosemaratisbonensis、褶皱臂尾轮虫Brachionusplicatilis。LCFAL 2的保守基序,参数为:结构域最小氨基酸残基数为 6 aa,结构域最大氨基酸残基数为50 aa,不同结构域的数量为5,其余参数为默认设置。通过NCBI Conserved Domains Search (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd)对LCFAL 2蛋白的结构域,再使用TBtools软件进行分析。
1.3 LCFAL 2蛋白的系统进化分析
采用Blast工具将东方蜜蜂微孢子虫LCFAL 2氨基酸序列比对到GeneBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)以搜索序列相似性较高的其他物种的LCFAL 2。通过Mega 11.0软件(Tamuraetal., 2021)对东方蜜蜂微孢子虫和上述其他物种的LCFAL 2构建系统进化树,选择默认参数。
2.1 LCFAL 2蛋白的分子特性
LCFAL2共含有1 836个核苷酸,可编码611个氨基酸(MEKRTNKNKFGEISHTNFLENIEC LQNGSKTLLEVFSSTCQKYENKNFLGTIKDNKLIWQT FSEINIKIQKLSTFLNSILQENAIFGIFSVNRYEWIVSE LAGYMSNCINCPLYSTFGPDAVNLIINETEMTVCCVS GDKAESLLDILLSSKKHFLKDIIIFDDDFNRENEFLDL EINVHYISQIFLETEINLRSNKLDLNSLATICYTSGTSG IPKGVQITHKNFIANISAFFRGQTKNEMYRVSDSEVY LSYLPLAHIMERIVVHVITSVGGSIGFYRGNPKKIESD YLIVRPTFIIAVPRVLNIFKQKIEEGVAERGKLSKFIFN IALKIKMWLQCRGSVKCWPLDSLIFNKISNKFGGRIK ACLCGSAALSHNVLTFLKATMSMRIFQGYGQTETTG ATTLCPLDGDNFDNVGIPYPSCKIKLSPVDGHDKYSG ELLVKGDNVTKGYFKRPELNAELFTEDNWLKTGDIA RFYNGVFKIIGRTKDRFKTGHGEYIEPEKIETLLTGGL IQDIIITTLKGYDKLLALVVCEKEGIQEKEVLDYLIKK GNKLVDDKKMNRYEIPSHIILLKKGFDTFDGGKLLSP TAKKIRVKIEKFFYEDIKRALSKK)。LCFAL 2的分子式为C3145H4985N813O904S23,分子量约为69.39 kDa,脂溶系数为96.82,等电点为8.79。LCFAL 2中含量最高和最低的氨基酸分别为异亮氨酸和色氨酸(表1);包含71个负电荷氨基酸,其中天冬氨酸和谷氨酸分别有30和41个;82个正电荷氨基酸,其中精氨酸和赖氨酸分别有21个和61个(表1)。
表1 LCFAL 2蛋白的氨基酸组成
LCFAL 2的平均亲水系数为-0.161,亲水氨基酸数量比疏水氨基酸多(图1-A),说明其可能为亲水性蛋白。在LCFAL 2中不存在跨膜螺旋域(图1-B),LCFAL 2中不存在典型的信号肽,说明其可能为胞内蛋白(图1-C)。另外,LCFAL 2含有64个磷酸化位点,包括27个丝氨酸磷酸化位点,14个酪氨酸磷酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点(图1-D)。
图1 LCFAL 2的亲水/疏水性(A)、跨膜螺旋域(B)、信号肽(C)和磷酸化位点(D)
LCFAL 2含有240个(39.28%)α-螺旋,124个(20.29%)延长链,48个(7.86%)β-转角,199个(32.57%)无规则卷曲(图2-A)。LCFAL 2三级结构的模板为5mst.1.A,LCFAL 2与5mst.1.A之间的同源性为21.44%(图2-B)。此外,预测LCFAL 2同时定位于细胞质、线粒体和细胞核,占比分别为52.20%、21.70%和17.40%。
图2 LCFAL 2的二级结构(A)和三级结构(B)
2.2 LCFAL 2蛋白的保守基序与结构域分析
在东方蜜蜂微孢子虫的LCFAL 2中鉴定到 6个保守基序:motif 1, motif 2, motif 3, motif 4, motif 5和motif 6;类似地,在蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫(TBU15843.1)、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、巨蟹肠孢菌、毕氏肠细胞虫、烟粉虱、管孢属微孢子虫和褶皱臂尾轮虫的LCFAL 2蛋白中也鉴定到上述6个保守基序(图3),说明LCFAL 2在东方蜜蜂微孢子虫和其他9个物种中高度保守。东方赤孢子虫(TBU20354.1)中不含保守基序6。此外,东方蜜蜂微孢子虫、管孢属微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、巨蟹肠孢菌、烟粉虱、毕氏肠细胞虫、东方赤孢子虫、褶皱臂尾轮虫的LCFAL 2含有AFD_class_I superfamily结构域;在兔脑炎微孢子虫、肠脑炎微孢子虫的LCFAL 2含有FAA1结构域。
图3 东方蜜蜂微孢子虫和其他9个物种LCFAL 2的保守基序和结构域
2.3 LCFAL 2蛋白的系统进化分析
搜索结果显示,东方蜜蜂微孢子虫含有1个LCFAL 2,蜜蜂微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、巨蟹肠孢菌、肠细胞虫、烟粉虱、管孢属微孢子虫和褶皱臂尾轮虫也含有1个LCFAL 2,而东方赤孢子虫和兔脑炎微孢子虫均含有2个LCFAL 2(表2)。系统进化分析结果显示,东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、巨蟹肠孢菌和毕氏肠细胞虫的LCFAL 2聚为一个大支,而东方赤孢子虫、烟粉虱和管孢属微孢子虫的LCFAL 2聚为另一个大支(图4);东方蜜蜂微孢子虫LCFAL 2(XP_024331795.1)与蜜蜂微孢子虫LCFAL 2(EQB61677.1)聚为一支,进化距离最近(图4)。以上结果说明东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫的LCFAL 2亲缘关系最近,LCFAL 2在不同微孢子虫中具有较高的保守性。
图4 邻接法构建基于LCFAL 2的东方蜜蜂微孢子虫与其他9个物种的系统进化树
表2 东方蜜蜂微孢子虫与其他9个物种的LCFAL 2概览
目前,东方蜜蜂微孢子虫的LCFAL2研究缺失。本研究中,生物信息学分析结果显示,东方蜜蜂微孢子虫的LCFAL2含有1 836个核苷酸,编码611个氨基酸,分子式为C3145H4985N813O904S23,分子量约为69.39 kDa,脂溶系数为96.82,等电点为8.79,说明该氨基酸为碱性氨基酸;平均亲水系数为-0.161,亲水氨基酸数量比疏水氨基酸多(图1-A),说明LCFAL 2可能为亲水性蛋白;不含跨膜结构域(图1-B),说明LCFAL 2可能不是跨膜蛋白;不存在典型的信号肽,说明LCFAL 2可能是胞内蛋白(图1-C);主要定位于细胞质,进一步说明LCFAL 2可能在细胞质中发挥功能。以上结果丰富了东方蜜蜂微孢子虫的LCFAL2的基本信息,为进一步开展相关研究提供了理论依据。
本研究发现东方蜜蜂微孢子虫LCFAL 2中含有6个保守基序(motif 1, motif 2, motif 3, motif 4, motif 5和motif 6),上述6个保守基序同样存在于蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、巨蟹肠孢菌、毕氏肠细胞虫、烟粉虱、管孢属微孢子虫和褶皱臂尾轮虫的LCFAL 2中(图3),表明LCFAL 2在上述物种中较为保守。此外,在东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微孢子虫等8个物种中均鉴定到AFD_class_I superfamily结构域,表明LCFAL 2在上述8个物种中具有较高的保守性。AFD_class_I superfamily属于非核糖体肽合成酶A结构域,负责催化ATP形成(李根,2017)。推测东方蜜蜂微孢子虫LCFAL 2具有催化ATP形成的功能,参与能量合成。
东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫是感染蜜蜂的两种主要微孢子虫,互为姐妹种(梁勤和陈大福,2009)。本研究中,系统进化分析结果显示东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫的LCFAL 2聚为一支,进化距离最近,表明二者的LCFAL 2亲缘关系最近(图4),符合客观事实。研究表明LCFAL 2参与真核细胞的增殖、分化和凋亡(Tomodaetal., 1991;Xuetal., 2011)。推测LCFAL 2在东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫侵染蜜蜂宿主的过程中发挥功能,值得进一步探究。下一步拟建立东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂或中华蜜蜂Apisceranacerana工蜂的模型(Paldietal., 2010),并通过饲喂特异性dsRNA或siRNA对处于侵染过程的东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2进行RNAi,以探究LCFAL2的分子功能。
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