常见食源性病原菌的快速检测技术研究进展

俞 佳,岑叶平,江玲丽,高有领

食源性病原微生物可引发疾病,它们可以通过水、土壤、空气等媒介传播,并在食品加工、运输和贮藏等环节污染食品,对人类造成不同程度的危害[1-2]。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计显示,每年约有1/10的人因食源性微生物感染而患病,给公共卫生带来严重负担,且5岁以下儿童具有更高的患病风险[3]。如今由食源性病原微生物引起的疾病仍时有发生,如何快速、高效地检测食源性病原微生物成为食品安全问题的关键所在。

微生物引发的食源性疾病为美国患者住院和死亡的主要原因,最常见的病原菌有单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,简称单增李斯特菌)、大肠杆菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、弧菌属(Vibriospp.)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)和产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli(STEC))等[4]。一旦从污染的食品中摄入这些病原菌,就会给人体造成不同程度的危害(表1)。以单增李斯特菌为例,它是一种重要的人兽共患病原体,研究证明,牛是其主要的无症状携带者,单增李斯特菌不仅可以通过牛和牛乳进行传播,而且在牛粪施肥后的土壤上也有较强的生存能力,从而给农产品带来污染的风险。此外,其他肉类、奶制品、鱼类也是其传播媒介[5]。单增李斯特菌可导致肠道感染,患者出现发热、肌肉酸疼、恶心、呕吐等症状,严重者还会穿越人体的大脑屏障和胎盘屏障,导致败血症、脑膜炎及孕妇流产[6],在免疫力低下人群中具有较高的病死率[7]。

表1 常见食源性病原菌对人的主要危害

传统的食源性病原菌检测方法一般采用平板培养,并结合生化鉴定和血清型鉴定。该方法应用范围广、准确率高、操作简便,检测成本低,至今仍是检测病原微生物的金标准。但由于其耗时长、出现假阴性的概率较大[4],逐渐不能满足当下食品快速检测的要求。随着科学技术的日新月异,已建立了多种快速检测食源性病原微生物的方法,并逐渐成为检测行业的标准。本文总结食品中常见病原菌的各项检测技术并比较各自优缺点,以期能为今后的食品安全快速与现场检测提供参考和依据。

1.1 免疫层析法 免疫层析法(Immunochromatographic Assay,ICA)是建立在层析法与抗原-抗体特异性反应上的一种快速免疫识别检测技术。其原理是待测样品溶液与检测试纸中的抗体反应后,溶液因毛细管作用沿硝酸纤维素膜向上移动。若溶液中含有目标菌,可与在膜上的检测线(T)上固定的特异性抗原或抗体结合并显色,从而特异性检出目标病原菌。同时,该膜上还有一条质控线(C),无论有无目标菌,该线上固定的特异性抗原或抗体都可以与结合垫上的抗体结合而显色,从而判断结果是否有效[16]。

免疫层析法包括胶体金免疫层析法、基于磁性纳米颗粒的免疫层析法和荧光微球免疫层析法等[17-19]。其中胶体金免疫层析法具有检测快速、准确率高、成本低、便于现场检测等特点,在食品微生物的检测中应用较为广泛[20-21]。我们前期建立了一种检测单增李斯特菌溶血素(LLO)的胶体金试纸,在15 min内即可对样品进行检测,检测速度快,且具有特异性强、稳定性高、重复性好的特点,检出限可达3×105CFU/mL[20]。为了提高试纸的检测效率,多联检测试纸应运而生。夏诗琪等[21]制备出了可同时检测5种沙门氏菌的胶体金试纸,检出限达到105~106CFU/mL,实现了对5种沙门氏菌的同时检测。胶体金多联检测试纸大大提高了检测效率,在食品检测中具有较高的应用价值。

1.2 免疫吸附法

1.2.1 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)是基于抗原抗体反应的一种检测方法。该方法将抗体(或抗原)固定在固相载体上,使酶标的抗原(或抗体)和待测样本进行竞争性结合,根据加入含酶底物后溶液的显色情况对样本进行定性和定量检测,具有检测速度快、特异性强、灵敏度高等特点,已广泛应用于食品和医学等检测领域[4,22]。

传统的ELISA方法具有设备昂贵、抗体制备流程复杂且不同批次的抗体质量差异较大、容易产生交叉反应等局限性[4],现已开发多种ELISA与其他技术相结合的新方法。Pang等[23]开发了一种基于纸张的ELISA检测方法(P-ELISA),使用该方法对致病性大肠杆菌O157∶H7进行检测,检测限可达到1×104CFU/mL,且无需依赖大型设备,携带方便,有利于现场检测。Gu等[24]研制了一种特异性纳米抗体,该抗体可与辣根过氧化物酶结合,无需额外制备二抗,有效缩短了检测时间,降低了检测成本。研究显示该方法检测肠炎沙门氏菌的检测限可达5×104CFU/mL,且经8 h富集,在牛奶中的检测限可达10 CFU/mL,与传统ELISA方法相比具有更高的灵敏度。因此将ELISA与其他技术相结合,研发出更灵敏、快捷的检测方法,是目前研究的热点方向之一,应用前景较广阔。

1.2.2 荧光免疫吸附法 荧光免疫吸附法(Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay, FLISA)是利用免疫吸附原理,将抗体(或抗原)固定在固相载体上,并用荧光物质代替传统的辣根过氧化物酶等物质标记抗体(或抗原),使其与待测样本进行竞争性结合,激发荧光标记物,最后通过荧光信号的强弱对目标病原菌进行定性或者定量鉴定[25]。

黄伟华等使用荧光微球作为标记物,利用双抗体夹心荧光免疫吸附法对单增李斯特菌进行定量检测,并与传统ELISA法进行比较。结果显示ELISA法的检测限为107CFU/mL,荧光免疫吸附法的检测限为105CFU/mL,灵敏度比ELISA法提高了两个数量级,且与其他致病菌无明显交叉反应[26]。可见荧光免疫吸附法较酶联免疫吸附法具有更高的灵敏度和特异性。

1.3 免疫磁珠分离技术 免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic bead separation techniques, IMBS)是将特异性抗体包被于磁珠之中,以此来捕获目标抗原,并在磁场的作用下对目标抗原进行分离和富集,从而达到快速分离目标抗原的目的。免疫磁珠分离技术有着效率高、可重复性好、速度快、操作简便等优点,可代替传统检测中选择性增菌的步骤[27]。

Wang等[28]通过免疫磁珠分离技术与流式细胞相结合,富集并检测了生菜和草莓中单个大肠杆菌O157活体细胞,该检测过程需5.7 h,检测限可达1 CFU/25 g。与传统分离培养方法相比,大大缩短了检测时间,提高了检测效率。但由于免疫磁珠价格过于昂贵,且只能对目标病原菌进行富集与分离,还需结合其他技术对病原菌进行进一步鉴定,限制了其在实际检测中的广泛应用。

免疫学检测方法检测食源性病原菌具有准确率高、特异性强、速度快等优点,已广泛应用于食品检测领域,但同时也存在设备或试剂昂贵、操作复杂等缺点,如何进行进一步优化,是目前主要的研究热点之一。

2.1 传统核酸检测方法

2.1.1 聚合酶链式反应 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)由美国Mullis于1986年发明,它实现了核酸分子在体外短时间内大量扩增[29]。该方法通过设计病原菌的特异性引物进行PCR扩增,并在琼脂糖凝胶电泳后通过凝胶成像仪对产物进行验证,即可完成对目标样品检测。PCR反应具有特异性强、灵敏度高、成本低等优点,已广泛应用于食源性病原菌的检测之中[4]。但其每次只能检测一种病原菌,且不能进行定量,存在一定的假阳性[4,30]。

为解决PCR反应只能单通量检测的缺陷,建立了多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)技术。mPCR可针对多个目标病原菌设计多对引物,使其在同一体系中进行PCR扩增,以实现多个病原菌的同时检测。Tao等[31]建立了一种可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、致病性大肠杆菌等11种病原菌的通用引物介导的mPCR检测方法,检测限可达103~104CFU/mL,其中对霍乱弧菌和福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)的检测限可达102CFU/mL[31]。Boukharouba等[32]基于mPCR,建立了一种可同时检测致病性大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。该研究将四种病原菌于缓冲蛋白胨水(BPW)中进行统一增菌后,使用mPCR法对其进行同时检测。该方法的检测限可达10 pg/μL,且BPW肉汤可有效支持四种病原菌的共同生长,从而减少因不同病原菌各自分离培养所需的时间和成本。但mPCR的特异性不高,引物设计复杂,且仍存在不能定量分析,无法区分活菌和死菌,因而仍具有一定的局限性[33]。

2.1.2 荧光定量PCR 荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是基于PCR反应,在反应体系中加入荧光染料或荧光探针等荧光物质,利用荧光信号的变化对整个反应进行实时监测,即可得到DNA扩增的实时数据,实现对目标病原菌的定量分析。与普通PCR相比,qPCR具有更高的特异性和灵敏度,且可实现对目标病原菌的定量分析[34-35]。

Vizzini等[36]基于qPCR设计了一对引物CampyPFw和CampyPRv,可同时对4种弯曲杆菌进行鉴定,该方法无需预增菌步骤,且具有较高的灵敏度,检测限约为4.6×102cells/mL。王华健等[37]通过分别设计三对特异性引物和探针,建立了可同时检测大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌和单增李斯特菌的多重qPCR方法,结果显示该方法具有较好的特异性,检测限为104copies/μL,并具有较好的重复性。为改进荧光定量PCR方法无法区分死菌与活菌的缺点,张俊彦等利用叠氮溴化乙锭(EMA)与实时荧光PCR技术相结合来检测食品中的单增李斯特菌活菌。结果显示,该方法与传统的细菌分离培养法结果一致,且在10 h左右完成检测,时间远短于传统检测方法,检测限可达55 CFU/反应[38]。

qPCR的缺点为检测成本较高,容易产生交叉污染,且加样时温度、速度等因素均会影响结果,对操作者的技术要求较高[33,39]。

2.1.3 数字PCR 数字PCR(digital PCR,dPCR)是可以对核酸分子进行绝对定量的检测技术。dPCR可将体系中的样本分成几十万份,使每个反应单元尽可能仅包含一份核酸样品,从而分别进行扩增反应,通过检测到的荧光信号大小对目标物质进行定性和绝对定量分析。dPCR技术在检测中无需建立标准曲线或添加标准物质,且检测限低,准确率高,在食源性病原菌的检测中具有较大的优势[40]。

Suo等[41]开发了一种芯片数字PCR(chip digital PCR,cdPCR)技术用以快速检测复杂食品基质中的鼠伤寒沙门氏菌,该方法仅需2 h完成检测,检测限可达90 CFU/反应,捕获效率为94.5%,该方法实现了预增菌与定量检测的结合,有利于现场检测。He等[42]基于微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR),建立了可从食品中检测致病性大肠杆菌的方法,并可同时检测其产生的志贺毒素。该方法无需预增菌,在苹果汁中的检测限可达2 CFU/mL。dPCR动态范围受反应单元数量限制,在分析前需要对样品进行稀释,且dPCR的仪器和试剂较昂贵,检测成本较高[43]。

2.2 核酸等温扩增检测方法

2.2.1 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术由Notomi等于2000年首次发表[44],该方法通过两对特异性引物识别目的基因的6个特异性序列,反应在恒温(60 ℃~65 ℃)下进行,具体步骤如图1[45]所示。LAMP方法反应速度快,通常在1 h内就可以完成对目标样品的检测,且特异性强、成本低。与PCR反应相比,LAMP可直接对样本进行检测,无需进行增菌,反应的结果可通过不同方法(比浊法、钙黄绿素等)用肉眼直接判断,无需通过凝胶电泳检测,且LAMP反应的灵敏度比PCR高10~100倍[46]。

注:A.起始物合成阶段。1-2. 在Bst DNA聚合酶的作用下从内部引物FIP开始合成互补DNA链;3-5. 外部引物F3与模板结合,置换FIP连接的互补链,并在5′端处形成茎环结构;6-8. 在下游内部引物BIP作用下延伸DNA链,并在下游外部引物B3作用下置换DNA,最终形成两端都有茎环的结构的产物。B.循环扩增阶段。8-11. 双茎环DNA作为第2阶段循环扩增的模板,在内引物和Bst DNA聚合酶引导下进行循环扩增,最终扩增出长短不一的花椰菜状DNA

Hassan等[47]建立了一种基于LAMP快速检测肉类和牛奶中金黄色葡萄球菌的方法,该方法以致病性金黄色葡萄球菌的femA基因和arcC基因为靶基因进行LAMP反应,整个检测过程需要1.3 h,且该试验的灵敏度较PCR反应提高了100倍。Jainonthee等[48]建立了一种基于RNA反转录(RT)与LAMP相结合的RT-LAMP法,用于实时检测鸡肉中的空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni),该方法使用9 min即可使反应达到最佳阈值,且可在3 h内完成整个检测过程,检测限可达103CFU/mL。但由于LAMP反应至少需要设计两对特异性引物,引物设计较为繁琐,且在检测过程中容易产生非特异性扩增与污染,距离初步的产业化应用还需要进一步研究[49]。

2.2.2 重组酶聚合酶扩增技术 重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术也是一种等温扩增技术,该方法由Piepenburg等于2006年首次提出[50]。RPA通过重组酶与引物结合模板中的同源序列结合并插入模板中形成D-环结构,再在单链结合蛋白与DNA聚合酶作用下进行延伸,使用凝胶糖电泳或荧光探针检测扩增产物,以达到对目标病原菌定性或定量检测的目的(图2[51])。相对于LAMP,RPA可在更低的温度下(37 ℃~42 ℃)进行反应,反应时间仅需5~20 min,且灵敏度高,特异性强,操作更为简便[52]。

注:A. 重组酶与引物结合,形成重组酶引物复合体;B. 重组酶引物复合体定位到DNA模板上的同源序列;C. 重组酶引物复合体插入DNA序列形成D-环结构,启动链置换反应;D. 单链结合蛋白与解开的DNA链结合,防止进一步置换;E. 在DNA聚合酶作用下,DNA开始复制延伸;F.两条新的双链互补DNA形成

Li等[53]基于RPA技术,结合光敏比色法来检测沙门氏菌,结果显示该试验在1 h内即可完成,检测限为5×103CFU/mL,对沙门氏菌进行6 h增菌后,检测限可达3 CFU/mL。Du等[54]将RPA技术与侧流层析试纸结合,建立了一种快速检测单增李斯特菌的方法,该方法可在15 min内完成检测,检测限为15 CFU/mL,对样品进行预增菌6 h后,检测限可达1.5 CFU/mL。目前RPA商业化的试剂盒较少,试剂价格相对较高,且没有专门设计引物的软件,仅用于实验室研究,在食品检测行业中还未得到广泛应用[55]。

2.3 基因芯片技术 基因芯片技术又称DNA微阵列技术,其原理是将大量核酸探针片段按阵列方式固定在载体表面上,使被标记的样本核酸片段与之杂交,通过杂交时产生的信号强弱对样品进行定性或定量分析。基因芯片技术具有通量高、特异性强、速度快、灵敏度高、可区分活菌与死菌,目前应用比较广泛。但基因芯片价格昂贵,且制备复杂,重复性较差,需要专业的操作人员,因此如何优化该技术,使之简便化与低成本化,是目前研究的热点之一[56]。

Srinivasan等[57]设计了一种高密度微阵列同时鉴定14种食源性病原微生物,该技术使用金标记银增强(gold labeling with silver enhancement,GLS)方法,并通过使用高分辨率的平板扫描仪量化反应过程中金沉积与银增强所产生的信号,从而对目标样品进行定量分析。该高密度微阵列避免了假阳性的产生,具有与PCR相似的灵敏度,且无需使用昂贵的激光扫描仪,是一种经济且可靠的微阵列检测方法。Li等[58]设计了一种可视化DNA微阵列芯片,以同时检测食品中常见的病原体。该方法将mPCR与基因芯片技术结合,将碱性磷酸酶及其底物引入试验,可通过肉眼直接判断结果,并通过比色法对目标物质进行定量分析,该方法的检测限小于102CFU/mL,具有较高的灵敏度。

2.4 新型快速核酸检测方法

2.4.1 核酸-微流控芯片 核酸-微流控芯片技术是基于小型微流控芯片进行核酸扩增并检测扩增产物,从而鉴别病原菌的一种快速检测方法。微流控技术由Whitesides于2006年提出,该技术特征是使用微米级通道对流体进行精密操控[59]。微流控技术可将样品制备、反应、分离、分析等步骤集成于一块微小的芯片上,集成度高、检测速度快、成本低、灵敏度高,可实现高通量检测和现场检测[60]。将微流控芯片与核酸检测结合,无需使用大型且昂贵的核酸扩增设备,既降低了成本,又便于现场检测,有较大的市场潜力。目前,应用于食源性病原菌检测中的核酸-微流控技术有PCR-微流控芯片技术、LAMP-微流控芯片技术和RPA-微流控芯片技术等(表2)。下面将应用比较多的PCR-微流控技术与LAMP-微流控技术进行介绍。

表2 核酸-微流控技术在食源性病原菌快速检测中的部分应用

Kopp等[61]于1998年首次建立了将PCR与微流控技术相结合的检测技术,PCR-微流控技术与传统PCR技术相比,体系温度更为均匀,检测的灵敏度与准确率大大提高,是目前快速检测食源性病原菌的研究热点之一。Zhang等[62]建立了一种新型PCR-微流控芯片来检测大肠杆菌O157∶H7,该技术通过在反应通道中泵入磁珠,并对其施加多环高梯度磁场,以高效获取样品中的DNA,结果表明该方法对大肠杆菌O157∶H7的检测限可达12 CFU/mL,具有较高的灵敏度。为了降低检测成本,方便现场检测,Salman等设计出一种便携的分流PCR微流控装置。该装置在体系循环时可较快进行加热和冷却,进而缩短反应时间。同时,该技术通过结合低成本且高灵敏度的锁定光电检测器对样品进行实时荧光检测,实现了对致病性大肠杆菌的定量检测,对致病性大肠杆菌dsDNA的检测限可达0.7 ng/μL[63]。同时,张道远等[64]设计出一种高集成度的数字PCR-微流控芯片,该芯片实现了数字PCR芯片的小型化,便于携带,且进样率高、样品损耗少、成本较低,可以满足一般实验室的检测需求。

LAMP与微流控技术结合,可优化LAMP的性能并缩短检测时间,提高检测效率、灵敏度和特异性。同时LAMP-微流控技术还可对病原菌进行高通量检测与现场实时检测,市场前景广阔[65]。Xiang等开发了一种基于微流控芯片与LAMP结合的快速检测方法,以检测零食中11种常见的沙门氏菌血清型。该方法实现了对样品的高通量检测,且在40 min内可完成整个反应过程,检测限可达102~103CFU/mL。结果显示该方法的血清型检测结果与传统方法一致,可满足有关部门对沙门氏菌监测的需求[66]。Luo等[67]建立了一种基于微流控芯片,并将LAMP和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a进行系统集成来检测沙门氏菌的方法。该技术通过两个微小的通道分别添加反应试剂,从而实现了在一个芯片上进行两步反应,避免LAMP溶液转移到CRISPR/Cas反应溶液时可能导致的气溶胶污染和交叉污染的问题。同时,整个检测过程可在50 min内完成,反应速度快,且对粗提的基因组DNA检测限可达118 pg/μL,具有较高的灵敏度。

使用核酸-微流控芯片技术检测食源性病原菌,成本低、集成度高、灵敏度高且特异性好,便于现场检测,具有取代传统检测法的潜力。但作为近几年兴起的新技术,该方法还未被大范围应用,且具有对仪器精密度要求高等局限性,未来将往更全面、精准且自动化的方向发展[68]。

2.4.2 肽核酸荧光原位杂交技术 荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)技术是利用荧光标记核酸探针,通过探针与目标核酸的特异性杂交来激发荧光,产生荧光信号,从而对目标样品进行鉴定的一种快速检测方法[75-76]。肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一种DNA类似物,与DNA探针相比,具有更高的亲和力、稳定性和特异性,故而代替普通的核酸探针广泛应用于单增李斯特菌和沙门氏菌等食源性病原菌的鉴定中[74-76]。Rocha等[77]建立了一种基于PNA-FISH技术来快速检测食品中单增李斯特菌的方法,该方法使用已知PNA探针与一种新型阻断剂探针以1∶2比例耦合替代原有的PNA探针,结果显示该方法在不同的食品基质中对单增李斯特菌的检测限可达0.5 CFU/mL(g),总体准确度为99%,特异性高、灵敏度强、准确度高,且使用离心法,在29 h内可完成整个检测过程,检测速度较传统方法快。杨彤等[75]建立了一种液相PNA-FISH技术来检测沙门氏菌,该方法的检测限可达104CFU/mL,与传统检测方法相当,但该方法具有更好的特异性、准确性与重复性,并大大缩短了检测时间,为沙门氏菌的检测提供了一个快速且较可靠的新方案。

PNA-FISH技术法检测食源性病原菌,可以提高检测的特异性与准确度,并缩短检测时间,但该技术需依赖荧光显微镜并使用PNA探针,价格昂贵,多用于实验室的检测,较难在整个行业中推广[78]。故如何优化PNA-FISH技术,降低成本,使其广泛应用到现场检测之中,是该项研究的重中之重。

分子生物学检测方法速度快,特异性强,灵敏度高,但多需要借助大型的检测仪器,给现场检测带来不便。核酸-微流控芯片技术的出现,较好地解决了这个问题,其仪器依赖性较小,方便携带,且集成度高,为现场检测与实时检测带来可能。

3.1 电化学生物传感器 生物传感器主要由生物感受器和信号转换器组成,可将信号识别、转导、放大集于一体。生物传感器基于细胞、组织、核酸、酶、抗体、抗原等物质来识别目标物质,并将其转化为光、电、磁等其他信号输出,从而完成对目标物质的定性与定量检测[79]。电化学生物传感器通过感受器识别目标物质时产生的电流、电位、电阻或电导的变化来对目标物质进行定量,具有灵敏度高、成本低、操作简便、可实时分析、检测速度快等优点,广泛应用于食源性病原微生物的检测之中[79]。

Nordin等[80]开发了一种电化学DNA生物传感器,其使用聚乳酸稳定的金纳米颗粒(PLA-AuNPs)来修饰电极,并利用DNA杂交来检测副溶血性弧菌。该生物传感器可以特异性区分不匹配的、非互补的和互补的核酸片段,且无明显的交叉反应,具有较高的特异性和灵敏度。Saini等[81]基于碳纳米纤维/金纳米颗粒(CNF/AuNp)电极的电化学生物传感器,首次使用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶基因(PlcA)作为核酸探针,来检测牛奶样品中的单增李斯特菌。该方法在30 min内可完成检测,灵敏度为3 461(μA/cm2)/ng,检测限可达82 fg/6 μL。

3.2 光学生物传感器 光学生物传感器通过接收生物受体与被标记的物质直接发光或在反应过程中产生颜色、化学发光、荧光等光学信号,并将其转化为电信号,从而对目标物质进行定量检测。此外,还有表面等离子体共振(SPR)和表面增强拉曼光谱等方法,通过反应过程中环境光学特性的变化来检测目标物质,无需额外提供标记物。光学生物传感器灵敏度高、检测速度快、检出率高,已广泛应用于食源性病原菌的检测之中,但其仪器昂贵,且检测时易受环境的干扰,对环境要求较高[82-84]。

Zheng等[84]开发了一种基于多孔gold@platinum纳米催化剂(Au@PtNCs)的光学生物传感器,并与被动式三维微混合器结合来快速检测鼠伤寒沙门氏菌。该方法使用磁分离技术,可在99 min内分离得到10%的目标菌,检测限可达17 CFU/mL。Khateb等[85]基于局域表面等离子体共振(LSPR),开发了一种不需要标记物的光学生物传感器。该方法无需预增菌步骤,只需2 min即可完成整个分析检测过程,在牛奶中金黄色葡萄球菌的检测限可达103CFU/mL。

3.3 质量生物传感器 质量生物传感器是基于共振现象,通过感应传感器表面微小的质量变化对目标物质进行检测,无需标记物的参与。根据换能器的不同可分为压电生物传感器和磁弹性生物传感器。质量生物传感器具有高灵敏度、快速、便捷等特点,但目前在食源性病原微生物的检测方面应用不广泛,具有较大的发展潜力[86]。

刘素芹等[87]设计了一种以压电生物传感器为基础的自动化微生物检测仪来检测病原微生物。结果显示用该方法检测致病性大肠杆菌,检测限可达到10 CFU/mL,与传统平板分离法的准确度相当,但更为快速、便捷,灵敏度更高。Wang等[88]设计了一种基于噬菌体磁弹性生物传感器来检测菠菜中的沙门氏菌。对沙门氏菌富集7 h后进行检测,检出限可达100 CFU/25 g,检测速度比美国食品药品监督管理局BAM方法的检测速度(24~26 h)快了3倍多。

生物传感器法也是目前较新兴的检测方法,其可对目标病原菌进行实时定量分析,且具有较高的灵敏度,但由于其对仪器精密度的要求和对环境的要求较高,限制了其的广泛应用。

目前,对食源性病原菌的检测技术仍以传统的分离鉴定方法为主,各种现代检测技术共存[4]。传统的平板培养分离鉴定法耗时长,不利于现场检测,而新近发展的快速检测技术耗时短,克服了这一缺点。但由于不同的现代检测技术具有不同的优势与局限性,还需进行进一步优化。如免疫学检测方法利用抗原抗体反应对病原菌进行检测,速度快、特异性强、灵敏度高,但其抗体制备复杂且重复性较差,与其他技术相结合开发出更灵敏、快捷的检测方法,是将来研究的方向。

在分子生物学检测方法中,mPCR可以实现快速多重检测;qPCR则解决了普通PCR不能定量的问题;dPCR可对目标物质进行绝对定量,且准确度更高;基因芯片技术通过分子杂交原理,可对样品进行定量分析及实现大批量样品的同时检测。随着等温扩增技术的兴起,LAMP、RPA等技术均被运用到了食品中病原菌的检测之中。这几种方法均具有灵敏度高、特异性强、速度快等特点,但其操作复杂,且仪器试剂昂贵,需要专业的技术人员,给现场检测带来一定的困难。微流控技术的引入,则较好地解决了这个问题。将微流控芯片与核酸检测技术结合,既可以对样品实现较为快速的检测,又避免依赖大型仪器,适合现场检测。目前基于微流控芯片的检测技术正处于前期研发阶段,在将来会向更全面、精确、简便且自动化的方向发展。

生物传感器检测技术具有结果可视化、功能多样化、智能化的特点,检测结果更加准确。但由于其仪器昂贵,且光学生物传感器对环境的要求较高,故而在实际应用中仍需进一步研究完善。

食源性病原菌的现场检测是有效监测和预防食源性疾病的关键环节,相信随着科学技术的进一步发展,可建立更为准确、快速、便捷且性价比高的检测方法,应用到现场检测之中,以更好地预防病原菌的传播与感染,保障广大消费者的食品安全,推进改善民生福祉,助力健康中国行动计划

利益冲突:无

引用本文格式:俞佳,岑叶平,江玲丽,等.常见食源性病原菌的快速检测技术研究进展[J].中国人兽共患病学报,2024,40(2):123-133. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.024

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