陈金霞,耿 兵,何倩毓
(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆 163319)
保幼激素(Juvenile hormone, JH)是主要由昆虫咽侧体合成并分泌的脂溶性倍半萜类激素。Wigglesworth于1934年在研究吸血蝽Rhodniusprolixus时首次发现和报道,随后Röller等在1967年确定了JH的倍半萜结构(Rölleretal.,1967)。截止目前,昆虫中存在至少8种天然JH,分别是JH 0、JH I、JH II、JH III、4-甲基JH I、JHB3、JHSB3和甲基法尼酯(Methyl farnosate, MF)。其中JH III是最常见的JH形式,在多数直翅目、蜚蠊目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、鳞翅目以及双翅目等昆虫中均被发现;而JH 0、JH I、JH II以及4-甲基JH I仅存在于鳞翅目昆虫中;JHB3以及JHSB3则分别是双翅目短角亚目昆虫和半翅目昆虫所特有(Belles, 2020a);MF一直被认为是甲壳类动物中的JH,它比JH III缺少一个环氧基,但近期研究发现MF在果蝇也具有类似JH的功能(Wenetal., 2015)。
顾名思义,JH的命名是基于早期发现JH具有使昆虫幼虫蜕皮后维持幼虫状态的作用。然而近年来大量研究表明JH仅在昆虫幼虫发育至临界龄期或达到临界体重时才可发挥“维持现状”以及阻止昆虫变态的作用(Tanetal., 2005; Daimonetal., 2012; Daimonetal., 2015; Inui and Daimon, 2017; Nouzovaetal., 2021)。除此之外,JH在昆虫生殖、滞育、行为、免疫以及社会等级决定等方面均发挥着重要的调控作用(Jindra, 2019; Truman, 2019; Jindraetal., 2021b)。然而,无论JH在昆虫中是以哪种化学结构形式存在抑或发挥哪种生理功能,其调控作用都是由其受体介导的。目前大量研究成果表明,JH可通过胞内受体及膜受体两个途径来发挥其生理功能。本文将围绕JH胞内受体和膜受体的相关研究进展进行综述,以期为进一步深入阐明JH分子作用机制、开发设计新型害虫防治及益虫利用的昆虫生长调节剂提供帮助。
1.1 Met作为JH胞内受体的发现及鉴定
JH胞内受体的发现得益于果蝇便捷的遗传操作手段。不同于其他昆虫,对果蝇幼虫外源施加JH并不会产生超龄幼虫以及抑制变态,而是仅在预蛹期处理时可阻止成虫腹部表皮形成和刚毛形态发生,以及导致雄性生殖器翻转不完全和阻止成虫羽化等表型(Madhavan, 1973; Zhou and Riddiford, 2002)。施加JH类似物(JH analogs, JHA)如methoprene或pyriproxyfen可产生强于JH所产生的形态缺陷效应,导致果蝇死亡(Wilson and Fabian, 1986)。基于这一现象,Wilson和Fabian(1986)利用正向遗传学操作方法筛选能够耐受methoprene的果蝇突变体以期获得JH受体基因,最终发现位于X染色体上的某一基因缺失的果蝇品系可耐受methoprene产生的致死以及形态发生缺陷效应,因此将该基因命名为methoprene-tolerant(Met)。然而,奇怪的是DmMet无义突变体Met27除产卵能力下降、胸部肌肉以及视神经系统表现出微弱的表型缺陷外,可正常存活(Wilson and Ashok, 1998; Wilsonetal., 2006; Abdouetal., 2011),这一现象与JH受体缺失的理论表型相矛盾。随后研究发现,果蝇中存在另一个基因Germcell-expressed(Gce)与Met同源,二者均属于bHLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-Arnt-Sim)转录因子家族成员,在bHLH、PAS-A和PAS-B结构域的相似性分别为78%、68%和86% (Mooreetal., 2000)。进化分析表明,DmMet是由DmGce复制产生的,相对于DmMet,DmGce与其他昆虫中的Met同源性更高(Baumannetal., 2010)。功能研究发现,DmGce无义突变体gce2.5K具有类似Met27的表型,且二者同时缺失后(Met27gce2.5K)可导致果蝇在预蛹期死亡(Abdouetal., 2011),表型类似JH缺失果蝇(Liuetal., 2009)。更为重要的是该致死表型可分别被DmMet或DmGce过表达果蝇挽救(Abdouetal., 2011; Jindraetal., 2015)。以上结果表明DmMet和DmGce在果蝇幼虫变态发育过程中功能冗余,可能同时作为JH受体介导JH信号传导。
与果蝇不同的是,赤拟谷盗Triboliumcastaneum仅含有1个Met基因。在赤拟谷盗预蛹前期,RNAi降低TcMet的表达可阻止外源JH诱导次级蛹的产生,并且大部分可正常羽化为成虫。更为重要的是,在3龄或4龄期RNAi降低TcMet的表达,可导致幼虫在5龄或6龄提前变态,形成小蛹(Konopova and Jindra, 2007),该表型与RNAi降低JH甲基转移酶(JH acid methyltransferase, JHAMT)导致JH缺失的表型完全类似(Minakuchietal., 2008)。同样地,在不完全变态昆虫始红蝽Pyrrhocorisapterus以及德国小蠊Blattellagermanica中也观察到MetRNAi导致昆虫提前变态的现象(Konopovaetal., 2011; Lozano and Belles, 2011)。与此同时,体外结合实验表明,DmMet和DmGce以及赤拟谷盗、衣鱼等昆虫Met均可与生理水平浓度的JH III结合,其中DmMet、DmGce以及TcMet与JH III结合的解离常数Kd值分别为5.3±4.5 nM、19.3±4.5 nM、2.94±0.68 nM (Miuraetal., 2005; Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2015),且结合位点被证明位于PAS-B结构域(Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2015)。果蝇遗传学实验进一步证明,当DmMet或DmGce PAS-B结构域中JH结合位点突变后,DmMet或DmGce均丧失挽救Met/Gce双缺失果蝇Met27gce2.5K预蛹期死亡表型的作用(Jindraetal., 2015)。综合以上结果,表明Met (果蝇中还包含Gce)是JH胞内受体。
1.2 Met转录活性调控
bHLH-PAS转录因子通常以二聚体的形式发挥转录调控作用(Edwards and Gorelick, 2022)。Met作为bHLH-PAS转录因子家族成员,最早被发现可与自身形成同源二聚体或与Gce结合形成异源二聚体,但这两类二聚体均可被JH所解离(Godlewskietal., 2006)。Li等(2011)利用酵母双杂交系统从埃及伊蚊Aedesaegypti的cDNA文库中筛选JH存在时可与Met结合的蛋白,发现JH可促进βFtz-F1结合的类固醇激素受体共激活物(βFtz-F1 interacting steroid receptor coactivator, FISC)(果蝇中称为Taiman,Tai)与Met结合参与JH对下游基因的诱导表达。研究发现,Met和FISC的PAS-A和PAS-B结构域对二者的结合是必需的,且当Met PAS-B结构域中JH结合位点突变后,可阻碍Met-FISC二聚体形成(Charlesetal., 2011; Lietal., 2011)。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)和凝胶迁移(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验结果表明JH促进下游基因earlytrypsin(ET)的表达依赖于Met-FISC二聚体与ET启动子区域中JH反应元件(JH response element, JHRE)的直接结合(Lietal., 2011)。并且Met-FISC二聚体与JHRE的结合依赖于二者的bHLH结构域,分别将Met或FISC bHLH结构域中的碱性氨基酸突变后可显著降低受体复合物与JHRE的结合,暗示Met和FISC同时结合于JHRE的不同区域(Lietal., 2014)。随后在家蚕、赤拟谷盗、果蝇、始红蝽、德国小蠊、飞蝗Locustmigratoria中均发现FISC同源类似物(后文统称为Tai)是Met介导JH信号传导中必不可缺的共激活因子(Zhangetal., 2011; Kayukawaetal., 2012; Guoetal., 2014; Lozanoetal., 2014; Smykaletal., 2014a; Royetal., 2018; Lietal., 2019; Jindraetal., 2021b)。近期,Jindra等(2021)利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中共转染赤拟谷盗TcMet和TcTai,经纯化及质谱鉴定证实JH促进Met和Tai以1∶1的比例结合形成功能异源二聚体介导JH信号传导(Jindraetal., 2021a)。除Tai外,Cycle (CYC)是另一个可与Met结合的bHLH-PAS共激活因子。在埃及伊蚊雌蚊中,Met/CYC异源二聚体介导了JH以光周期依赖形式对Krüppelholomog1(Kr-h1)和Hairy转录表达的激活(Shinetal., 2012)。
除bHLH-PAS转录因子家族成员与Met结合形成功能受体复合物外,分子伴侣Hsp83通过与细胞质中Met的bHLH和PAS-B结构域结合后可维持Met构象稳定,有利于Met与JH的结合(Heetal., 2014)。进一步研究发现,JH与细胞质中Met结合后,可进一步促进Met与Hsp83结合,JH-Met-Hsp83复合体在Hsp83的协助下与核孔蛋白Nup358 N端的肽重复序列(tetratricopeptide repeat, TPR)结合后位于核孔周围,最后在入核转运载体importin β作用下入核。入核后,Met与Tai结合形成功能受体复合物后作用于Kr-h1启动子上游JHRE,促进Kr-h1的表达。Hsp83突变或加入Hsp83抑制剂或超表达TPR抑制Hsp83与Nup358的结合,均可阻碍Met的细胞核定位,导致Met与JHRE结合能力下降,使得Kr-h1转录表达水平降低(Heetal., 2014; 何倩毓和张原熙, 2016; Heetal., 2017)。值得注意的是,近期Jindra等(2021a)研究发现JH可促进共表达于sf9细胞中的TcMet与TcTai的结合,而降低Hsp83与TcMet的结合。JH对Met-Hsp83结合能力调控的差异推测可能是由于JH存在时,体外过表达TcTai后可与sf9细胞内源性Hsp83竞争结合Met的PAS-B结构域,从而使得Met与Hsp83结合能力下降。
磷酸化修饰是影响Met-Tai受体复合物转录活性的另一因素。埃及伊蚊中的研究发现,JH通过激活磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)信号通路,引起细胞内二脂酰甘油(Diacylglycerol, DAG)、三磷酸肌醇(Inositol trisphosphate, IP3)以及Ca2+浓度的增加,进而激活钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)及蛋白激酶C (Protein kinase, PKC)。CaMKⅡ和PKC进一步通过磷酸化Met和Tai来增强Met-Tai复合体与JHRE的结合。加入λ蛋白磷酸酶处理可显著降低Met-Tai复合体与JHRE的结合(Liuetal., 2015)。近期,Met磷酸化位点在棉铃虫Helicoverpaarmigera、埃及伊蚊以及赤拟谷盗中陆续被报道(Jindraetal., 2021a; Kimetal., 2021; Lietal., 2021)。Li等(2021)以棉铃虫为研究对象,借助多个磷酸化位点预测工具以及点突变手段发现JH有且仅可促进HaMet1 PAS-B结构域中第393位苏氨酸(Thr393)磷酸化。将该磷酸化位点突变后导致JH促进的HaMet1与Tai的结合,以及HaMet1与JHRE的结合能力下降,最终使得JH诱导的Kr-h1转录表达水平降低。此外,Thr393磷酸化位点突变后可阻碍JH诱导的HaMet1-HaMet1二聚体的解离,以上结果表明JH诱导HaMet1 Thr393磷酸化是HaMet1-HaMet1同源二聚体解离、HaMet1-HaTai二聚体形成以及HaMet与JHRE结合所必需的(Lietal., 2021)。与之不同的是,对埃及伊蚊以及赤拟谷盗Met磷酸化的研究发现Met存在多个磷酸化位点。通过液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)方法分别在埃及伊蚊以及赤拟谷盗Met中鉴定到7个和10个磷酸化位点,并且发现JH既可以促进Met某些位点的磷酸化,也可以导致某些位点的去磷酸化发生(Jindraetal., 2021a; Kimetal., 2021)。此外,值得注意的是,赤拟谷盗中TcMet磷酸化位点突变后既不影响TcMet的配体结合能力,也不影响TcMet的细胞核定位及其与JHRE的结合(Jindraetal., 2021a; Gao,etal., 2022)。不同昆虫中Met磷酸化位点以及磷酸化修饰对Met功能的影响所表现出的差异,究竟是由于物种特异性还是由于实验操作方法不同导致的仍有待进一步研究。
1.3 Met功能研究进展
作为JH胞内受体,Met的功能主要是参与JH对昆虫的生理调控。早期研究主要集中于Met介导JH对昆虫变态发育的调控。如前所述,RNAi降低Met的表达或Met突变后可导致完全变态昆虫或不完全变态昆虫提前变态,表型类似于JH缺失(Konopova and Jindra, 2007; Abdouetal., 2011; Konopovaetal., 2011; Lozano and Belles, 2014; Smykaletal., 2014b; Daimonetal., 2015; Villalobos-Sambucaroetal., 2015b; Maetal., 2018; Cuietal., 2021)。JH抑制昆虫变态发育的分子作用机制目前已被证实,主要是通过促进Met-Tai复合体与Kr-h1启动子区JHRE的直接结合来诱导Kr-h1的表达。Kr-h1作为JH的初级反应基因进一步通过直接抑制20E信号通路中的蛹期特异因子Broad(Br)和成虫特异因子Ecdysoneinducedprotein93F(E93)的表达,或直接抑制前胸腺中20E合成通路中关键酶(如Spookier)基因的表达来阻止昆虫变态(Lozano and Belles, 2011; Kayukawaetal., 2012; Belles and Santos, 2014; Kayukawaetal., 2016; Kayukawaetal., 2017; Liuetal., 2018b; Zhangetal., 2018; Belles, 2020b; Martinetal., 2021; He and Zhang, 2022)。值得注意的是,在JHAMT-/-;mod(可导致家蚕幼虫提前变态形成小蛹)双突变家蚕以及Met1-/-家蚕中发现,阻断JH合成或JH信号传递并没有引起家蚕在1、2龄期提前变态,而是最早在3龄幼虫期产生提前变态的表型(Daimonetal., 2015; Cuietal., 2021)。同样的,在埃及伊蚊中的研究也发现,基于CRISPR(Clutered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats) /Cas9基因编辑技术敲除Met或JHAMT对埃及伊蚊的胚胎及1、2龄幼虫的发育并不产生影响,而是在3龄或4龄幼虫期,虫体才开始出现黑色的蛹表皮并在化蛹前死亡(Zhuetal., 2019; Nouzovaetal., 2021)。基因表达分析发现,Met突变后导致参与黑化作用、蛹和成虫表皮合成以及成虫吸血后的消化等过程中的相关酶基因在4龄幼虫中提前表达,表明直到埃及伊蚊发育至3龄或4龄幼虫阶段,JH才通过Met抑制蛹/成虫提前变态(Zhuetal., 2019)。同样在不完全变态昆虫始红蝽中RNAi降低Met的表达最早可使3龄若虫出现微弱的提前变态现象(Smykaletal., 2014b)。以上研究表明,JH-Met在完全变态昆虫和不完全变态昆虫的早期胚后发育过程中并不是必需的,只有当昆虫发育到“临界龄期”时,JH才通过Met发挥阻止昆虫变态的作用。
除调控昆虫变态发育外,对昆虫的生殖调控是JH又一重要的生理调控作用。在绝大多数雌性昆虫中,脂肪体中卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)的合成、以及卵母细胞的成熟都受JH调控(Royetal., 2018; Santosetal., 2019; Song and Zhou, 2020; Wuetal., 2020; Khalidetal., 2021),并且该作用也被证明是由Met所介导。如在不完全变态昆虫始红蝽、吸血蝽、臭虫Cimexlectularius、沙漠蝗Schistocercagregaria和飞蝗、甲虫蟑螂Diplopterapunctata、白背飞虱Sogatallafurcifera等昆虫中的研究发现,RNAi降低Met的表达可部分甚至完全阻断Vg的合成、卵母细胞的成熟以及卵子发生(Guoetal., 2014; Marchaletal., 2014; Smykaletal., 2014a; Villalobos-Sambucaroetal., 2015a; Gujar and Palli, 2016; Gijbelsetal., 2019; Huetal., 2019),该表型与部分已获得的JH缺失昆虫的表型类似(Guoetal., 2014; Smykaletal., 2014b)。飞蝗中的一系列研究表明,JH通过Met上调DNA复制基因Mcm4和Mcm7以及细胞周期基因Cdc6,Cdk6和E2f1,从而促进脂肪体细胞多倍体化,有利于脂肪体中Vg的快速大量合成,为大量卵子的同步成熟提供保障(Guoetal., 2014; Wuetal., 2016, 2018)。此外,JH还可通过LCMT1-PP2A-FOXO途径诱导细胞周期相关基因Cdc2和Orc5的表达促进脂肪体细胞多倍体化,从而调控Vg合成以及卵巢成熟(Wuetal., 2020)。在完全变态昆虫赤拟谷盗雌虫中,RNAi降低Met或JHAMT的表达也发现可导致脂肪体中Vg的表达量下降。并且JH-Met调控Vg的表达被证明是通过促进胰岛素样肽(insulin-like peptides, ILPs)信号通路中ILP2和ILP3的表达后,磷酸化FOXO,使得FOXO出核,从而诱导Vg表达。RNAi降低Met或JHAMT导致ILP表达量下降,从而使得FOXO定位在细胞核内,FOXO通过与Vg启动子上的FOXO反应元件结合抑制Vg表达(Shengetal., 2011)。埃及伊蚊中的研究发现JH-Met还可通过上调E75来调控miR-2940-3p的表达,进而影响卵巢滤泡细胞形成及卵子成熟(Aksoy and Raikhel, 2021)。果蝇中,如前所述Met27或gce2.5K的产卵能力显著下降(Abdouetal., 2011),这一表型近期被证明是由于大量成熟卵子积累在卵巢中不能排出所致(Luoetal., 2021)。利用来源于果蝇Kr-h1启动子区域中一段JH反应区域(JH response region,JHRR)构建的JHRR-LacZ果蝇来指示JH胞内信号(Heetal., 2014),发现JH胞内信号在果蝇卵巢肌肉细胞以及成虫脂肪体中活跃。RNAi分别降低卵巢肌肉细胞或成虫脂肪体中Met、gce或Kr-h1的表达可显著降低果蝇产卵率,伴随大量成熟卵子在卵巢积累从而使得卵巢增大,该表型类似Met27或gce2.5K果蝇。进一步分析发现,Met、gce或Kr-h1RNAi后导致参与组装卵巢肌肉细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的Laminin和Collagen IV的相关基因mRNA表达量分别在卵巢肌肉细胞和成虫脂肪体中降低,使得ECM组装受损,从而导致卵巢肌肉收缩缺陷,引起排卵障碍(Luoetal., 2021)。此外,该团队还发现JH信号在维持卵巢生殖干细胞的数量方面具有重要的作用。Met27、gce2.5K或JHAMT突变体果蝇,以及在卵巢帽细胞中特异性降低Met或Gce的表达均可导致卵巢生殖干细胞的数量随着果蝇成虫发育逐渐降低(Luoetal., 2020)。
JH对昆虫生殖滞育的调控同样是通过Met来实现的。具有生殖滞育特性的雌成虫在受到光周期或温度等外部环境刺激后,咽侧体停止合成JH,低水平的JH通过抑制Vg的表达以抑制卵巢发育,从而促进滞育的发生。RNAi降低Met的表达可获得类似的表型(Smykaletal., 2014a; Liuetal., 2016; Maetal., 2021)。此外,JH还可通过Met抑制昆虫免疫(Schwenke and Lazzaro, 2017; Changetal., 2021)、维持肠道细胞平衡(Rahmanetal., 2017)、促进脂质积累(Wangetal., 2017b)、交配(Bilenetal., 2013)以及等级分化(Masuokaetal., 2015; Masuokaetal., 2018)等来间接调控昆虫生殖。
值得注意的是,有些昆虫中含有2个Met基因,它们在介导JH对昆虫生理调控过程中的作用并不是完全一致的。如家蚕中的BmMet1和BmMet2,其中BmMet1不含内含子,BmMet2含有9个内含子并且各内含子所处位置与DmGce和TcMet类似(Guoetal., 2012; Kayukawaetal., 2012)。不同于DmMet与DmGce在幼虫变态发育过程中功能冗余,BmMet1和BmMet2在家蚕幼虫发育阶段过程中功能完全不同。Diamon等(2015)利用TALEN介导的基因编辑技术分别获得BmMet1和BmMet2突变体,发现BmMet1突变体发育延迟,大部分在2～3龄幼虫蜕皮阶段死亡,并且在3龄幼虫T2和T3胸节隆起处的表皮可观察到点状的蛹壳特征。同样,近期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的BmMet1突变体也观察到在3龄幼虫的表皮中出现幼虫-蛹嵌合体的表型(Cuietal., 2021);然而BmMet2突变体却可正常羽化并可育,未表现出任何异常表型,表明在家蚕幼虫阶段主要是BmMet1作为JH受体介导JH对家蚕幼虫变态发育调控(Daimonetal., 2015)。然而与体内试验不同的是,在人肾上皮细胞HEK293T中的单杂交报告系统检测发现JH可激活BmMet2-Gal4DBD诱导UAS报告基因的表达,而对BmMet1-Gal4DBD不产生效果;并且JH可促进BmMet2与共激活因子Taiman/SRC结合后作用于JHRE,发挥转录激活作用(Kayukawaetal., 2012; Kayukawa and Shinoda, 2015)。由此可见BmMet1和BmMet2均可作为JH受体参与JH信号传递。转录表达分析发现,在家蚕胚胎及幼虫阶段,BmMet2的mRNA表达水平显著低于BmMet1,但在蛹后期阶段,BmMet2的mRNA表达水平逐渐升高并在成虫阶段达到高峰(Kayukawa and Shinoda, 2015),因此推测BmMet1与BmMet2分别介导JH对家蚕不同发育阶段的调控,BmMet1是JH拮抗幼虫变态所必需,而BmMet2参与JH调控成虫生殖。近期,进化分析表明BmMet1是家蚕驯化过程中的1个候选驯化基因(Xiangetal., 2018),在家蚕幼虫脑发育及驯化中起着重要的作用。研究发现,BmMet1突变体的大脑发育滞后,且显著小于野生型家蚕大脑。分子进化分析表明,在人工选择过程中家蚕BmMet1第210位天冬氨酸取代了野桑蚕BombyxmandarinaMet的组氨酸,导致BmMet1结构发生改变,从而降低了BmMet1的转录活性,最终使得家蚕脑中与BmMet1共表达的基因网络弱于野桑蚕(Cuietal., 2021)。
果蝇DmMet与DmGce虽然均可作为JH受体发挥功能冗余的作用。然而JH调控果蝇成虫视神经分化以及交配行为等过程主要是通过DmMet来实现,DmGce突变对上述生理过程并不产生显著影响(Riddifordetal., 2010; Riddiford, 2012; Bilenetal., 2013)。如Met27果蝇可以像JH缺失果蝇一样引起预蛹期视叶和成虫盘中EcR-B1的提前表达,使得成虫视叶光感受器神经元提早分开,导致果蝇成虫视叶形态异常。而gce2.5K果蝇既不能引起EcR-B1提前表达,也不造成视叶发育异常(Riddifordetal., 2010; Riddiford, 2012)。此外,Met27果蝇和JH缺失果蝇的雌虫交配起始时间延迟,而Gce突变后对交配时间不产生影响(Bilenetal., 2013)。这一功能上的差异可能与二者组织差异性表达有关。Baumann等(2017)利用细菌人工染色体重组技术以及knock-in转基因技术分别获得DmMet-GAL4以及DmGce-GAL4果蝇品系用于分别检测DmMet及DmGce的时空表达。结果发现,DmMet在幼虫和成虫视叶中广泛表达,但DmGce的表达却完全检测不到;此外,虽然二者在卵母细胞发育的第8-10阶段的滤泡细胞中均有表达,但DmGce的表达弱于DmMet;在与行为密切相关的中央神经系统中,二者的表达也存在一定的差异(Baumannetal., 2017)。
目前市面上大约合成有4 000多种JH激动剂,其中一些激动剂被广泛用作杀虫剂。传统筛选JH激动剂作为杀虫剂的方法,主要是基于虫体或组织上的生测反应等形态学观察。但这种方法一方面无法进行大规模筛选,另一方面可重复性不强。JH受体的鉴定使得体外高效筛选JH激动剂成为可能。基于Met作为JH的受体以及JH-Met/Tai-Kr-h1信号传递模式,研究者已陆续在昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母中开发构建了多种报告基因分析系统(Reporter gene assay,RGA),用于高通量筛选天然JH以及人工合成的JH激动剂或拮抗剂,同时可用于分析相关化合物的功能结构(Chungetal., 2011; Leeetal., 2015; Miyakawa and Iguchi, 2017; Leeetal., 2018; Bittovaetal., 2019; Jindra and Bittova, 2020; Kayukawaetal., 2020; Yokoietal., 2020; Ito-Harashimaetal., 2021; Kayukawaetal., 2021)。RGA系统的核心部分是由Met、Tai以及报告基因组成,利用JH可促进Met与Tai结合形成功能受体复合物后驱动报告基因的表达的原理,来实现对JH激动剂或拮抗剂的研究或筛选。目前已报道的RGA系统主要有四大类:(1)在昆虫细胞中同时过表达Met、Tai以及JHRE报告基因载体,或利用昆虫细胞系内源性Met和Tai仅过表达JHRE报告基因载体;(2)在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO和人肾上皮细胞HEK293T)中利用双杂交荧光素酶分析系统(Two-hybrid luciferase assay),即将Met和Tai分别与VP16激活结构域(VP16 activation domain,VP16AD)和GAL4 DNA结合结构域(GAL4 DNA binding domain,GAL4DBD)偶联,同时引入可被GAL4DBD结合的报告基因载体;(3)在HEK293T中同时过表达Met、Tai以及JHRE报告基因载体;(4)在酵母细胞中同时过表达Met、Tai以及JHRE报告基因载体。
Miyakawa等(2017)利用(2)中的方法对比Met/SRC复合体对黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、埃及伊蚊、赤拟谷盗3种昆虫以及甲壳动物淡水水蚤Daphniapulex的4种幼虫同对JH激动剂的敏感度。研究发现,3种昆虫对JH III的敏感度显著高于淡水水蚤,并证明这一差异与节肢动物进化过程中Met序列中的一个关键氨基酸残基有关,而与共激活因子Tai无关。在甲壳动物中这一氨基酸为苏氨酸,而昆虫中为缬氨酸。将甲壳动物Met这一位点的苏氨酸突变为缬氨酸可显著提高对JH的响应(Miyakawaetal., 2013)。Bittova等(2019)分别利用(1)、(2)中的方法构建了基于果蝇S2细胞以及HEK293T的RGA系统,并对昆虫内源性JH(JH I、JH III、JHB3)以及这些内源性JH非活性的异构体进行分析,发现JH化学结构骨架中的C-C二酯键的立体构象(尤其是2,3位)对JH与Met的结合以及Met转录活性的激活至关重要,其次是位于N端的环氧化基团的手性构象。随后,Yokoi等(2020)利用(3)中方法也发现类似的结果,并且进一步发现延伸JH化学结构中C3位上的取代基或增加酯烷基可显著降低或破坏JH的活性。很显然,以上研究为今后人工合成新型高效的JH激动剂提供了有利的理论基础。近期Ito-Harashima等(2021)利用酵母的易操作、快速繁殖以及经济廉价等特点构建了(4)中的酵母RGA系统用于检测各类JH激动剂的活性。基于半数有效浓度(50% effective concentration, EC50)的对比,发现虽然该系统的敏感度不如Bittova等构建的HEK293T细胞上的RGA系统,但显著高于S2细胞以及CHO细胞上建立的RGA。因此,该系统可作为大规模筛选JH激动剂的有利工具。但由于酵母细胞壁的低渗透性使得该系统对亲水性的化合物不兼容,因此,利用该系统对亲水性的JH激动剂进行筛选将存在一定的限制。
同理,Lee等(2015)基于JH可促进Met与CYC结合,借助酵母双杂交系统及β-半乳糖苷酶定量分析,筛选可阻断由JH类似物pyriproxyfen诱导的Met-CYC结合的JH拮抗剂,最终从1 651种植物次级代谢物中获得5种具有JH拮抗剂活性的二萜烯类化合物(Leeetal., 2015)。此外,该研究团队从171种植物精油化合物中筛选获得4种含醛类功能团的JH拮抗剂及4种含酯类功能团的JH激动剂(Leeetal., 2018)。近期Kayukawa等(2020,2021)在家蚕BmN细胞系上构建可同时稳定表达由JHRE驱动的萤火虫荧光素酶以及由BmA3启动子驱动的海肾荧光素酶的稳转细胞系BmN-JF&AR。利用该细胞系对东京大学化学药品库的核心库中的9 600种化合物进行高通量筛选,通过4步筛选获得69个候选JH拮抗剂及10个候选JH激动剂。进一步通过对家蚕虫体处理的表型观察以及表皮离体培养后Kr-h1的转录表达水平的检测,最终发现编号为JHSI48的化合物为一种新型的JH拮抗剂(Kayukawaetal., 2020),而其中7种候选JH激动剂可延迟家蚕末龄幼虫变态(Kayukawaetal., 2021)。
除了利用各种RGA系统对JH拮抗剂或激动剂进行高通量的实验筛选,Yokoi等(2021)开发了一套基于果蝇Met蛋白结构模型的计算机模拟系统,从500万种化合物中筛选到11个候选JH激动剂。利用上述(3)中的RGA系统进行实验确认,最终发现1种结构与已往鉴定的JH激动剂不同的含哌嗪环的新型JH激动剂(Yokoietal., 2021)。由此可见,JH受体的鉴定以及JH信号传递途径的解析极大地促进了JH拮抗剂及激动剂的挖掘。
JH除通过结合胞内受体Met来发挥作用,还可通过膜受体途径调控昆虫的生理过程。早期果蝇中的研究发现,对离体培养的雄性果蝇副性腺施加JH可促进蛋白质的快速合成,并且JH对蛋白质合成的促进作用依赖于培养基中Ca2+和佛波酯对PKC的激活。在PKC活性缺失的果蝇突变体中,JH促进蛋白质合成的作用消失。该结果表明,某个膜受体介导了JH对蛋白质的合成,并且该信号传递过程中涉及Ca2+和PKC (Yamamotoetal., 1988)。
随后有关JH膜受体的大量研究工作转为以昆虫卵母细胞为研究对象。在成虫卵黄发生过程中,JH通过胞内受体复合物Met/Tai促进Vg在脂肪体中合成,脂肪体中合成的Vg经血淋巴循环到卵巢,再经由卵母细胞外围滤泡细胞之间的间隙(称为patency)到达卵母细胞表面,最后在卵母细胞表面Vg受体(Vg receptor,VgR)介导的内吞作用下被卵母细胞吸收(Raikhel and Dhadialla, 1992; Valle, 1993; Wangetal., 2017a; Wuetal., 2020)。早期实验发现,对吸血蝽的卵巢体外施加JH,可迅速降低滤泡细胞的体积而使滤泡细胞之间的间隙增大,从而有利于Vg的进入。这一过程被认为是由JH与位于滤泡细胞膜上的蛋白结合所介导的。进一步药物抑制实验发现,JH可通过与细胞膜上的蛋白结合激活PKC,PKC又通过磷酸化Na+/K+ATPase的α亚基来传递JH信号,最终调控滤泡细胞的间隙(Ilenchuk and Davey, 1983;Sevala and Davey, 1993;Webbetal., 1997;Pszczolkowskietal., 2005)。然而与JH结合的膜蛋白究竟是哪类蛋白却不清楚。
随着现代分子生物学技术的发展,JH膜受体的信号通路研究逐渐取得新的进展。Jing等(2018)在飞蝗中利用RNAi技术降低Na+/K+ATPase α亚基的表达可阻碍JH诱导的卵母细胞对Vg的吸收,导致卵巢发育缺陷,该实验从分子水平上证明Na+/K+ATPase在JH调控Vg进入卵母细胞过程中发挥至关重要的作用(Jingetal., 2018)。进一步研究发现JH可通过GPCR/RTK-PLC-IP3R-PKC信号通路磷酸化Na+/K+-ATPase的α亚基的第8位丝氨酸,从而激活Na+/K+-ATPase的活性,进而诱导patency的发生,最终促进Vg转运至成熟卵母细胞(Jingetal., 2018)。近期该团队进一步解析了JH调控patency的分子机制。JH通过GPCR、小G蛋白细胞分裂周期蛋白42(small GTPase Cell division cycle 42, Cdc42)和非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C, aPKC)信号通路激发细胞极性蛋白Par3磷酸化,使得滤泡细胞之间的黏着小带解聚,进而增大滤泡细胞的间隙,最终促进Vg转运至卵母细胞(Zhengetal., 2022)。利用转录组学在雌性飞蝗卵巢中已鉴定到22个GPCRs,RNAi筛选结果发现降低LGR4、Oct/TyrR、OR-A1、OR-A2、mAChR-C和CirlL这6个GPCRs的表达可导致卵母细胞中Vg的累积减少,阻碍卵巢发育和卵母细胞成熟。其中LGR4和Oct/TyrR被证明可能与脂肪体中Vg合成相关,而OR-A1、OR-A2、mAChR-C以及CirlL在Vg转运及吸收过程中发挥重要的作用(Zhengetal., 2021)。此外,JH还可通过GPCR-PLC-PKC-ι途径磷酸化VgR,使VgR由卵母细胞的细胞质转移至细胞膜上,从而与穿过滤泡细胞间隙到达卵母细胞表面的Vg结合,介导Vg的内吞(Jingetal., 2021)。除飞蝗中取得的大量研究进展,赤拟谷盗中GPCRs的RNAi筛选实验发现多巴胺D2样受体(Dopamine D2-like receptor,Dop2R)参与JH对滤泡细胞间隙的调控。类似于飞蝗中的研究结果,RNAi降低Dop2R的表达导致赤拟谷盗卵泡中Vg的积累降低、卵巢发育延迟、雌虫繁殖力以及幼虫孵化率显著下降。并且体外实验发现JH可以通过浓度依赖性方式抑制超表达Dop2R的HEK293细胞内cAMP的浓度(Bai and Palli, 2016)。值得注意的是,赤拟谷盗及飞蝗中GPCRs的RNAi筛选也发现一些GPCRs参与JH对Vg合成的调控(Bai and Palli, 2016; Zhengetal., 2021),这暗示着膜受体和胞内受体可能协同介导JH的信号传导。
如前所述,埃及伊蚊以及棉铃虫中的研究发现JH可通过磷酸化Met和/或Tai,以增强Met-Tai二聚体的形成及Met-Tai与JHRE的结合,从而促进JH对Kr-h1的诱导表达(Liuetal., 2015; Ojanietal., 2016; Lietal., 2021)。RNAi及药物抑制实验发现,当PLC、CaMKⅡ或PKC失活时,Met-Tai与JHRE的结合能力显著降低,从而阻碍了JH的信号传导(Liuetal., 2015; Ojanietal., 2016)。由此可见,JH膜受体和胞内受体介导的JH信号最终在调控细胞核内Met-Tai复合体的转录活性中产生交集,二者共同促进下游的转录调控。然而,值得一提的是,药物抑制实验结果表明,双翅目昆虫的JH-膜受体传导途径中的膜受体更倾向于是RTK而不是GPCR (Liuetal., 2015)。此外,该团队发现在埃及伊蚊成虫羽化时,JH可通过RTK-PI3K-Akt途径促进丝氨酸/精氨酸富集剪切因子(Serine/Arginine-rich splicing factors,SRSFs)的磷酸化,进而诱导Taipre-mRNA可变剪切形成A和B两种亚型。这两种亚型可作为EcR/USP的共激活因子促进20E信号,从而为后期雌虫吸血后20E诱导Vg的合成做准备(Liuetal., 2018a)。Kr-h1作为JH-Met/Tai信号通路中的效应分子,近期研究发现,JH还可通过促进Kr-h1磷酸化来诱导核糖体蛋白L36的表达从而促进脂肪体中Vg合成(Wuetal., 2021)。早期棉铃虫中发现JH可通过GPCR/PLC/PKC通路引起Br的磷酸化来拮抗20E诱导的变态(Caietal., 2014)。以上结果表明JH膜信号可与胞内信号通路在多途径中发生协同作用。
除与胞内受体协同介导JH信号传递,JH膜受体被证实还可独立于胞内受体发挥作用。借助果蝇遗传优势,Gao等(2022)在Met/gce双缺失果蝇(Met27gce2.5K)背景下发现JH仍可通过RTK-PLC-PKC途径使USP第35位丝氨酸被磷酸化,进而诱导ecdysone合成通路中Halloween基因的表达,从而最终增强20E的作用保证果蝇的正常生长发育(Gaoetal., 2022)。综上所述,JH信号传导既涉及胞内受体,又需要膜受体的参与,以及膜受体与胞内受体的协同作用。因此,膜受体的解析将为进一步深入了解JH的生理作用打开一个新的局面。
JH在昆虫发育、变态、生殖以及行为等方面发挥重要的调控作用,很显然这些作用必须通过其受体介导传递。近年来结合果蝇、赤拟谷盗、家蚕以及其他不完全变态昆虫中的研究,已证实Met(果蝇中包含Gce)可与生理浓度JH结合,作为JH的胞内受体通过与bHLH-PAS转录因子Tai或CYC结合形成功能受体复合物后直接结合JH靶基因(如Kr-h1,ET,Hairy)启动子区域的JHRE来促进靶基因的转录表达,进而介导JH抑制昆虫变态以及促进生殖等。功能研究发现,MetRNAi或Met突变体的表型类似JH缺失表型。此外,Met/Tai磷酸化修饰以及Hsp83对Met亚细胞定位的调控等影响Met转录活性因素的研究也取得了一定的突破。基于Met作为JH受体,一系列报告系统被开发用于筛选分析JH激动剂或拮抗剂。与此同时,有关JH膜受体信号通路的研究也逐渐明朗化。JH可能既通过GPCRs又通过RTK途径发挥作用。同时,JH可通过膜受体途径与核受体信号交互作用协同发挥功能。
尽管如此,有关JH及其受体的研究仍存在众多亟待解决的问题。例如,目前大量研究表明阻断JH的合成或其信号传递并不能引起昆虫在早期发育阶段提前变态,其原因被认为可能是昆虫早期幼虫体内缺乏变态所需的“感受态因子(Competence factor)”。Inui等(2017)通过将刚孵化出的1龄家蚕或2龄家蚕表皮移植至末龄幼虫上,可在末龄幼虫变态为蛹时观察到移植的表皮中出现蛹表皮,表明在末龄幼虫体内存在“感受态因子”,并且该“感受态因子”可被JH所阻断。然而究竟该“感受态因子”是什么?受哪些因素调控?其时空表达如何?以及“感受态因子”如何使昆虫具备变态的能力?目前仍不得而知。此外,在Met转录活性调控方面,除Tai和CYC以外,是否存在其他bHLH-PAS蛋白与Met结合参与JH信号传递,以及它们相互作用的分子机制?Met磷酸化修饰是否影响Met入核?除磷酸化修饰,Met是否还具有其他翻译后修饰,以及这些修饰对Met功能有何影响?关于JH膜受体,目前筛选到的各种GPCRs究竟是否是真实的JH膜受体?为什么在飞蝗、赤拟谷盗中发现GPCRs类膜蛋白可能为JH膜受体,而在双翅目埃及伊蚊以及果蝇中却发现是RTK类蛋白介导JH的膜信号传递?这一差异是否是由于双翅目在物种进化中引起的,还是由于GPCRs和RTK分别介导了JH的不同生理调控功能?JH膜受体的身份究竟是什么?对这些问题的解析将有助于我们进一步了解JH的分子作用机制,为更好地利用益虫以及寻找害虫防治的新靶点、新方法奠定理论基础。此外,虽然在细胞水平上利用各种报告系统筛选获得大量的JH拮抗剂和激动剂,但这些拮抗剂和激动剂是否能与Met结合,以及在虫体水平上是否具有功能仍有待深入研究。JH受体晶体结构的解析,必将极大地促进新型JH拮抗剂和激动剂的开发设计,为真正实现绿色害虫防治提供新途径。
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